Juan del Castillo nació en Belmonte (Cuenca), de familia noble. Fue el hijo mayor de diez hermanos. Sus padres, Alonso del Castillo, que fue regidor de la villa, y María Rodríguez, fueron un matrimonio distinguido por su honradez y virtud, que ofrecieron a sus hijos, no sólo las riquezas y blasones de su casa, sino el espíritu cristiano, que era el mejor patrimonio de las familias cristianas. Le bautizaron en la excolegiata de S. Bartolomé. Su partida de bautismo dice: “A 27 de septiembre de 1595, bauticé yo, Pedro Chaves, cura de la Colegial de esta villa, a Juan, hijo de Alfonso del Castillo y de María Rodríguez”.
Es uno de los tres jesuitas mártires de la región del Río de la Plata. Ellos son Roque González de Santa Cruz, Alfonso Rodríguez y Juan del Castillo. El 20 de octubre de 1558, S. Francisco de Borja había fundado el Colegio que la Compañía de Jesús en Belmonte, donde Juan pudo iniciar sus estudios de humanidades. Sus padres, después, le enviaron a la Universidad de Alcalá a estudiar “leyes”, artes y teología. Al terminar el primer curso, se despidió de los compañeros, anunciándoles que quería ser misionero, al sentir la llamada de Dios.
De allí, se trasladó a Madrid, al noviciado de los jesuitas, que había conocido en su pueblo natal, en el que fue admitido el 22 de mayo de 1614, con 18 años. Acabado el noviciado, el 2 de noviembre de 1616 va a Huete (Cuenca) para hacer sus estudios de Filosofía en el Colegio de la Compañía. Por allí, pasó el P. Juan de Viana, Procurador del Paraguay, “ponderando la abundancia de mies, de las almas, de las penalidades y fatigas de los misioneros y del martirio cierto…”. Esto enardeció el corazón de nuestro joven estudiante enamorado de Cristo y de su cruz. El hermano Castillo decide marchar a misiones “porque allí hay fama de mayor pobreza, fatigas y trabajos apostólicos”. Su integridad de vida, modestia, piedad y aplicación fueron extraordinarias. Antes de partir, acude a su pueblo, y se despide a los pies de su patrona, Ntra. Sra. de Gracia…
En Lisboa, conoce al P. Alfonso Rodríguez de Zamora, desde ese momento “compañero” de misión y martirio… Por fin llega a Buenos Aires, y de allí, en 1620 es enviado a La Concepción (Chile) donde imparte clase a los jóvenes, a los que deja impresionados por el ejemplo de su vida. Posteriormente irá a Córdoba (Argentina) a terminar sus estudios de filosofía y teología, y para aprender el “guaraní” para poder misionar entre los indios.
El 16 de Diciembre de 1625 es ordenado sacerdote. La víspera se ofrece al Señor con una sencilla oración: “¡Dame fuerzas…!”. El 8 de marzo de 1626 escribe una carta a su padre, que se guarda en el archivo parroquial, expresando sus anhelos misioneros y con sabor a despedida: “Dixe mi primera misa ocho días después de la fiesta de la Purísima Concepción de la Virgen Ntra. Sra. … Luego subiré a las misiones del Paraguay a trabaxar y morir entre aquellos indios de donde daré a vuestra merced, relación larga de cómo me fuere por allá… Ntro. Sr. ha sido servido de que los superiores me han señalado para las misiones del Paraguay. Saldré de aquí el 13 de junio para esta empresa de pelear con indios gentiles, donde se ofrecerán muchas ocasiones de larga paciencia”. Dos años después tiene la ocasión de dedicarse a la conversión de los indios en las célebres “reducciones” del Paraguay y del Uruguay. Las reducciones eran poblados indígenas en los cuales los jesuitas reunían a los indios para enseñarlos a trabajar establemente, convirtiéndolos al cristianismo y habituándoles a la vida civil. En primer lugar, irá a una “reducción” de los jesuitas de S. Nicolás de Paratiní, poco antes fundada por el P. Roque González, que después moriría mártir con él. El 14 de agosto de 1628 es destinado a Asunción (Paraguay), junto al río Yjuhí, donde él mismo funda una Nueva Reducción, que iba a ser el escenario de su martirio, en la que el 15 de agosto, congregó a 400 indios. Allí trabajó un cierto tiempo, recogiendo buenos frutos en la conversión y organización social, a pesar de la fiereza de los indígenas. Eran particularmente hostiles a los misioneros y a las reducciones. Fue uno de ellos, Nezú, el que entró en el poblado, organizado para conseguir sus beneficios. Enseguida, llegó al enfrentamiento en contra de los misioneros, conservando su concubina y procurando reconducir a los indios a la antigua fe de sus mayores. Nezú ordenó en noviembre de 1628 matar a los religiosos y quemar la iglesia. Primeramente, las víctimas fueron los padres Roque González y Alfonso Rodríguez, uno paraguayo y el otro español, que fueron asesinados el 15 de noviembre.
En los primeros momentos después del martirio, los mismos indios ya bautizados, cristianos, recogieron los despojos humanos que habían dejado, llevándolos como verdaderas reliquias de los “Santos Mártires”.
Fue beatificado por el Papa Pío XI, el 28 de enero de 1934, y canonizado por el Papa Juan Pablo II en Asunción (Paraguay), el 16 de mayo de 1988.